純化蛋白質(protein purification)

一、純化等級
(1) 粗蛋白 (crude protein)：採樣 → 均質打破細胞 → 抽出全部蛋白，多用鹽析沉澱法。
(2) 部分純化 (partially purified)︰初步的純化，使用各種管柱層析法。
(3) 均質蛋白質 (homogeneous)︰目標蛋白質的進一步精製純化，可用製備式電泳或 HPLC 等。
資料來源：國立臺灣大學
二、分離方法(method)

蛋白質純化技術
依大小	透析超濾膠體過濾蔗糖梯度超高速離心
依溶解度	等電點聚焦法鹽溶、鹽析
依帶電性	離子交換層析法
親和性純化	----
高效率層析法	----

1.蛋白質大小(Size)差異以分離

A. 透析（Dialysis）：

a. 將原溶液置於透析袋，再置於緩衝溶液中，小分子可通過透析袋進入緩衝液，透析袋內的小分子數目會減少，而大分子數目卻不變，重複多次之後就可以把小分子的數目降到很少。

b. 運用：脫鹽(Desalination)

B. 超濾(Ultrafiltration)：適用於處理體積較大量的樣本，運用在：濃縮蛋白質、置換緩衝液

C. 膠體過濾（Gel filtration）：膠体過濾法是一種 Partition 層析法。小分子可進入小珠子（beads）的孔洞內，大分子不可進入，因此小分子經過的路徑較長，會停留較久，而大分子經過路徑短，會較快流過。簡單來說，就是利用時間差以達到分離純化的目的

資料來源：bricker

D. 蔗糖梯度超高速離心(Surcose gradient centrifugation)：依蛋白密度差異而分離，密度越大的蛋白質越接近管底，密度越小的越接近液面。流程：

a. 利用儀器製造蔗糖梯度

b. 在液面緩緩滴入樣品形成薄膜

c. 放入離心機高速離心

d. 最後分裝溶液

資料來源：lyricsdog

2. 利用蛋白質溶解度（Solubility）差異

A. 等電點聚焦法（Isoelectric focusing,IEF）

a. 利用蛋白質等電點的不同來分離蛋白

b. 蛋白在某pH值下電荷為0→此pH質=等電點（pI）

c. 將蛋白質置於具有pH梯度的膠體進行電泳，它會朝著與自身所帶電性相反的電極方向移動，直到抵達pI處才停止運動。此過程蛋白被「聚焦」在等電點的窄帶中

資料來源：維基教科書

B. 鹽溶、鹽析（Salting in & Salting out）
@鹽溶 Salting-in：加鹽使蛋白質溶入水溶液中
@鹽析 Salting-out：加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來

	鹽溶（Salting in）	鹽析（Salting out）
原理	分子在其等電點時，容易互相吸引，聚合沉澱；加入鹽離子會破壞此吸引力，使分子散開，溶入水中	蛋白質表面的疏水性區域，都聚集許多水分子，當鹽加入時，這些水分子被抽出，以便與鹽離子進行水合，此時暴露出疏水性區域和親水性區域相互結合，形成沉澱
使用鹽離子	氯化鈉NaCl	硫酸銨(NH4)2SO4
濃度	150mM≒0.9％（較低）	40％~70％（較高）