在基礎生物學研究中,和在眾多的應用領域,如診斷,生物技術,法醫生物學,生物系統學中,DNA序列知識已成為不可缺少的知識。具有現代的DNA測序技術的快速測序速度已經有助於達到測序完整的DNA序列,或多種類型的基因組測序和生命物種,包括人類基因組和其他許多動物,植物和微生物物種的完整DNA序列。
一、基本方法
1.Maxam-Gilbert測序法:化學法會對操作者造成傷害
2.Sanger測序法
Sanger(桑格)雙脫氧鏈終止法是Frederick Sanger於1975年發明的。測序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應(PCR)。PCR過程中,雙脫氧核糖核苷酸可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由於雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個氧原子,一旦它被加入到DNA鏈上,這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進的方法,是將雙脫氧核糖核苷酸進行不同熒游標記。將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離,跑到最末端的DNA就可以在雷射的作用下發出熒光。由於ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP(4種雙脫氧核糖核苷酸)熒游標記不同,計算機可以自動根據顏色判斷該位置上鹼基究竟是A,T,G,C中的哪一個。
A.步驟
*Sanger法除了加入4個dNTP之外,另外也分別在四個試管中加入四個不同的ddNTP (兩者比例為dNTP:ddNTP = 200 : 1)
*當接上的為ddGTP,合成便會停止。在合成的過程中,因為接上ddGTP的長度是隨機的,所以可以得到各種長度的片段,此時進行電泳,從電泳最下面(最短,第一個便接上ddGTP)往上讀到最上面(最長,最後才接上ddGTP),這裡讀出的是primer的序列
*相同地,四個試管裡分別裝入Dideoxy A、Dideoxy G、Dideoxy T、Dideoxy C ,如此便可以得到許多小片段的基因,拿去跑電泳,得知分子量大小後,從電泳最下面(最短,第一個便接上ddGTP)往上讀到最上面(最長,最後才接上ddGTP),即可得知每段基因的最後一個鹼基為何,將大量的基因片段用電腦整理運算後,即可該基因的序列
資料來源:維基百科
資料來源:davidson
資料來源:mokkka
二、進階方法
1.霰彈槍定序法
霰彈槍定序法(Shotgun sequencing,又稱鳥槍法)是一種廣泛使用的為長DNA測序的方法,比傳統的定序法快速,但精確度較差。曾經使用於塞雷拉基因組(Celera Genomics)公司所主持的人類基因組計畫。
資料來源:自然期刊
▼遺傳物質(genetic material)
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