聚合脢連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)

一、成分
1.DNA 模板：雙股螺旋DNA 經高溫解離成單股DNA，作為PCR 反應的模版。以一般反應體積為50uL 而言，只需1~100ng 的DNA 就非常足夠了，太多的DNA 反而會降低反應的專一性。
2.Primer 引子：功能就像衛星導航一樣，能找到目標基因片段的頭、尾兩端。一般反應濃度約為0.2~0.4uM，太高或太低都不恰當，濃度太高時會降低反應的專一性，太低時反應就會失敗。
3.DNA Polymerase 聚合?：能將4 種核酸原料（dNTPs：dATP、dGTP、dCTP、dTTP）依照DNA 模板密碼，正確地一個一個地加上去，而合成新的ㄧ股基因片段。聚合脢的種類繁多，依其特性大致上可區分成一般聚合脢（Taq）、熱啟動（Hot-Start）聚合脢、校正（Proofreading）聚合脢三類。
4.MgCl2 氯化鎂：可提供鎂離子作為聚合?的輔因子，輔助聚合脢作用。一般都使1.5~2.0mM。若濃度太高，雖然可以增加PCR的產量，但是專一性會大幅降低；若濃度太低，則PCR 產量會大幅降低。
5.緩衝液：主要是由Tris、KCl 所調配成的緩衝液，pH 約8.4

資料來源：toxicologyguide

二、步驟
1. Denaturation：利用高溫（90~95℃）將雙股螺旋DNA 解離成單股DNA，再以單股DNA 作為複製的模板。
2. Annealing：溫度降低到適當溫度（不同的primers 其annealing溫度會有不同），讓引子黏結到正確的目標基因位置。（參考圖2的步驟2）
3. Extension：溫度調整到72℃，鎂離子作為酵素輔因子，讓DNA聚合脢依照模板上的密碼，開始將核酸原料（dNTPs）一個接著一個的加上去，合成另一股新DNA 片段。連續地重複30~40 次上面的三個步驟，只需要2 小時，理論上即可以將極微量的DNA 片斷大量複製約230~40倍（約幾十億倍）。
資料來源：genedragon

資料來源：紐芬蘭紀念大學
三、為了提升PCR 的效率（efficiency）或專一性（specificity），常需視不同的基因片段而要加入某些添加劑（Additives），例如：DMSO Glycerol、BSA、Formamide、Betaine…等等。這些添加劑作用的方式不太相同，分敘於下：
1. 甘油(Glycerol)：一般常用的濃度為5~10％，主要是增加聚合脢的熱穩定度（thermostability）。
2. DMSO：一般常用的濃度為2~10％，當DNA 片段模板的GC 含量太高時，DMSO 可以改變引子與DNA 模板雜交反應（Hybridization）的溫度（Tm）。
3.Formamide：一般常用的濃度為1~5％，作用與DMSO 相同。
4. BSA：一般使用不會超過0.8ug/uL，主要是增加聚合脢的熱穩定度（thermostability）。
5. Betaine：一般常用的濃度為0.5~2M，當DNA 片段模板的GC 含量太高，而且複製的DNA 片段較長時，Betaine 可以降低 denature 的溫度（92~93℃）與annealing 的溫度（降低1~2℃）
四、歷史
PCR這項技術是由凱利·穆利斯(Kary Mullis)發明，並因此在七年之後，1993年10月，獲得了諾貝爾化學獎該項殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程序的方法，並利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。
DNA聚合酶天然存在於生物體內，在細胞分裂前進行DNA的複製。當DNA開始複製時，解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便結合在兩DNA單股鏈上，生成互補鏈。在穆利斯最初的PCR反應中，將DNA聚合酶用於體外試驗。雙鏈DNA被加熱到96℃，使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個溫度下，DNA聚合酶被破壞，因此在每個循環的加熱步驟後必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反應效率極低，需要大量時間和DNA聚合酶，並且在整個PCR反應中都需要人來照看。
後來，由嗜熱細菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)體內產生的DNA聚合酶改善了這種低效的PCR反應。由於嗜熱細菌生活在溫度達到50至80 °C (122至176 °F)的間歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐熱性。在用於PCR反應時，高溫並不能破壞這種DNA聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶，PCR反應由此變得簡單並且可以由機器操作。
最初的具有耐熱性的DNA聚合酶來自於水生棲熱菌(Thermus aquaticus)，因此被稱為Taq。Taq酶被廣泛用於當前的PCR操作中。Taq酶的缺點是它缺少3'->5'校正外切酶活性，因此在複製DNA時有時會出錯，造成DNA序列突變(錯誤)。從古菌中獲得的Pwo酶及Pfu酶均有校正機制，能夠大大降低PCR反應中的突變。將Taq與Pfu結合使用可以保證真實準確得擴增DNA。
五、

There was a time when to amplify DNA,

You had to grow tons and tons of tiny cells.

Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,

Said you can amplify in vitro just as well.

Just mix your template with a buffer and some primers,

Nucleotides and polymerases, too.

Denaturing, annealing, and extending.

Well it's amazing what heating and cooling and heating will do.

PCR, when you need to detect mutations.

PCR, when you need to recombine.

PCR, when you need to find out who the daddy is.

PCR, when you need to solve a crime.

▼遺傳物質(genetic material) 顯示/隱藏(show/hide)